Протеиназа К: характеристики, ензимна активност и приложения

Протеиназа К е ензим, който принадлежи към групата на серинови протеази, т.е. има в своя активен каталитичен център аминокиселинен серин и има функцията да разрушава пептидните връзки чрез хидролиза. Този ензим от своя страна принадлежи към семейството на субтилизинови протеини (пептидаза S8).

Протеиназа К има молекулно тегло (MW) от 28 900 далтона и е изолирана за първи път през 1974 г. от екстракти от албума Engyodontium на гъбичките, бивш известен като Tritirachium album Limber.

Той има висок протеолитичен капацитет, демонстриращ, че е в състояние да разгражда кератина в косата. Думата кератин на английски е написана като "кератин", затова се нарича "протеиназа К".

Поради високия си капацитет за разцепване на природни протеини, този ензим е полезен в различни техники на молекулярна биология. Той се използва главно за изолиране и приготвяне на нуклеинови киселини с високо молекулно тегло (MW).

Протеиназа К действа чрез освобождаване на ядрената ДНК, докато унищожава протеините и инактивира РНКазите и DN-азите, т.е. елиминира нуклеазите в препаратите на ДНК и РНК.

От друга страна, е видно, че протеиназа К може да хидролизира някои денатурирани природни протеини, което е предизвикало интереса на изследователите за неговото използване при изследване на прионови протеини (PrP С).

Въпреки високата си протеолитична активност обаче има протеини, които са резистентни на действието на протеиназа К. Сред тях има някои анормални протеини, наречени приони (PrP Sc), свързани с трансмисивни спонгиформни енцефалопатии.

Характеристики на протеиназа К

Протеиназа К има третична структура, образувана от три слоя, с β лист от седем вериги, разпръснати между два слоя спирали. Тъй като принадлежи към семейството на S8 пептидаза, то се характеризира с наличието на каталитична триада в неговото активно място, чийто последователен ред е (Asp, His и Ser), което ги отличава от други пептидазни семейства.

Този ензим от групата на серинови протеази се характеризира чрез хидролизиране на пептидните връзки близо до карбоксилната група на алифатните и ароматните аминокиселини.

От друга страна, той е в състояние да действа в присъствието на някои корозивни вещества, като натриев додецил сулфат (SDS), Tris-HCL и EDTA, които се използват за подпомагане на денатурацията на протеини, което ги кара да загубят своята естествена структура.

Това е предварителна стъпка в приготвянето на протеини за техниката на електрофореза. Диапазонът на рН, при който протеиназа К действа, е доста широка (2.0 до 12.0), с оптимално рН между 7.5 до 12.0, и неговата изоелектрична точка е 8.9. Както може да се види, той е активен срещу много широк диапазон на рН.

Друга особеност, която се откроява в протеиназа К, е неговата стабилност в присъствието на високи температури (50 - 60 ° С).

Ензимна активност

Протеиназа К се нуждае от присъствието на калциев йон, въпреки че това не засяга неговата активност, ако е важно да се запази нейната стабилност.

За да може протеиназата К да извърши пълното разграждане на субстрата, е необходимо приблизително време на контакт между 5 минути и 2 часа.

Въпреки това, в този смисъл Daza et al., Сравняват чистотата на ДНК, получена в различно време на експозиция на протеиназа К, и стигат до заключението, че продължителното инкубиране (до 24 часа) значително подобрява качеството на ДНК.

Сега, по отношение на концентрацията, която се използва от ензимния протеиназа К в различните протоколи, може да се каже, че тя е много разнообразна.

Може да се използва от много ниски концентрации (5 μg / ml) до концентрации от 500 μg / ml. Но най-често срещаните работни концентрации варират между 50-100 μg / ml, особено за разграждане на протеини и инактивиране на нуклеаза. Въпреки че за третиране на тъкани е необходима концентрация от 2 mg / ml.

приложения

Неговите приложения са много широки и могат да бъдат обобщени в следното:

Използва се при разграждането на протеини и екстракцията на ДНК чрез няколко метода, като: осоляване, PK-SDS, цетил-триметил амониев бромид (CTAB), модифициран калиев ацетат и екстракция с натриев йодид.

-Инактивиране на нуклеази (РНКази и DN-ази).

-В техниката на хибридизация in situ (HIS), за подпомагане на освобождаването на нуклеинова киселина, в допълнение към елиминирането на нежелани протеини.

-Модификация на протеини.

-В нивото на изследванията, в различни изследвания.

Предимства на протеиназа К

Няколко сравнителни проучвания са били проведени между техники за екстракция на ДНК с използване на протеиназа К, с други, които не я използват, и всички заключават, че има по-големи ползи при използването на ензима. Сред предимствата могат да се посочат следните:

- Получава се ДНК с високо молекулно тегло, високо качество и чистота.

Извлечената ДНК е стабилна до 3 месеца.

Екстрахираната ДНК може да се използва в следните техники: Southern blot, полимеразна верижна реакция (PCR), електрофореза, наред с други.

Протеини, резистентни на протеиназа К

Няколко изследвания са стигнали до заключението, че прионите (анормални PrPSc токсични протеини) са диференцирани от PrPC протеини (естествени), защото са резистентни към действието на протеиназа К, докато PrPC са чувствителни към тяхното действие.

Други автори са описали, че в структурата на PrPSc има чувствителни части и други, резистентни към протеиназа К. Въпреки това, двете части са еднакво токсични и инфекциозни.

От друга страна, Bastian и сътрудници през 1987 г. са изолирали 4 вида протеини от 28, 30, 66 и 76 kda от вид Spiroplasma mirum . Всички те са резистентни на действието на протеиназа К и също реагират кръстосано с някои приони.

Известно е, че този вид може да причини катаракта и важни неврологични увреждания и поради научните открития на Bastian, наред с други изследвания, е направен опит за свързване на този микроорганизъм с трансмисивните спонгиформни енцефалопатии.

Въпреки това, етиологията на тази дегенеративна неврологична патология все още се дължи на прионите.

В този смисъл, Бътлър и сътрудници през 1991 г. са идентифицирали и характеризирали клас от протеиназа, устойчива на 40 Kda протеиназа от два щама Mycoplasma hyorhinis. Този патоген засяга прасета, заразявайки техните тъкани, но в този случай не е имало кръстосана реакция с тестваните приони.

Необходими са повече изследвания, за да се изясни много неизвестни за него.