Изпитване на каталаза: основа, техника и приложения
Каталазният тест е методология, използвана в бактериологичните лаборатории, за да докаже наличието на каталазния ензим в онези бактерии, които го притежават. Заедно с оцветяването на Грам са основните тестове, които трябва да се извършат върху новоизолираните микроорганизми. Тези тестове насочват микробиолога към стъпките, които трябва да следват за окончателното идентифициране на въпросния микроорганизъм.
Като цяло бактериите, съдържащи цитохром, притежават ензима каталаза, т.е. аеробните и факултативни анаеробни бактерии трябва да го притежават. Въпреки това, има изключения, като стрептококи, които въпреки факултативните анаеробни микроорганизми не притежават каталазен ензим.
Ето защо каталазният тест се използва главно за разграничаване на семействата Staphylococaceae и Micrococaceae (и двете каталазни положителни) от семейството Streptococaceae (каталаза отрицателна).
По същия начин, род Bacillus (каталаза положителен) се отличава от рода Clostridium (каталаза отрицателен), наред с други.
фундамент
Каталазата е ензим, класифициран като хидропероксидаза, което означава, че те използват водороден пероксид (H 2 O 2 ) като субстрат.
Също така се счита за оксидоредуктаза, тъй като в реакцията, когато има елемент, който служи като донор на електрони (редуциращо вещество) и друг като електронен рецептор (окислително вещество).
Каталазата е протеин, който съдържа протетична група с четири тривалентни железни атома (Fe +++), следователно е хомопротеин. Ферионният йон остава окислен по време на реакцията.
Може да се каже, че каталазата е детоксикиращ ензим, тъй като неговата функция е да елиминира вещества, които се получават по време на бактериален метаболизъм, които са токсични за бактериите. Сред тези вещества е водороден пероксид.
Водородният пероксид се образува от разлагането на захарите по аеробния път. Този процес се извършва, както следва:
Супероксидният йон (О2-) (свободен радикал) се образува като краен продукт от усвояването на глюкозата по аеробния път. Това е токсично и се елиминира от ензима супероксид дисмутаза, която го превръща в газообразен кислород и водороден пероксид.
Водородният пероксид също е токсичен за бактериите и трябва да се елиминира. Каталазният ензим разгръща водороден пероксид във вода и кислород.
Каталазата може да действа върху субстрати, различни от водороден пероксид, като алкохоли, алдехиди, киселини, ароматни амини и феноли. Въпреки това, водороден пероксид може да се използва и от каталаза за окисляване на други токсични съединения като метилов и етилов алкохол.
По същия начин, каталазата присъства в фагоцитни клетки, предпазвайки я от токсичното действие на водороден пероксид.
Рутинна техника за каталазния тест
- Метод на обекта
материали
3% водороден пероксид (10 обема).
Плъзнете стъкло
Пластмасова дръжка за еднократна употреба или дървена пръчка.
процес
Вземете достатъчно количество от колонията, за да изучавате, без да докосвате агара, откъдето идва. Колонията трябва да е прясна, т.е. от култура от 18 до 24 часа.
Поставете колонията върху сухата пързалка и върху нея добавете капка 3% водороден пероксид (може да се използва също така 30% H 2 O 2 ). Наблюдавайте веднага, ако мехурчетата се освободят или не.
интерпретация
Положителна реакция: отделяне на газ, което се доказва от образуването на мехурчета (силно барботиране).
Отрицателна реакция: няма образуване на балон.
- Директен метод в чиста култура
Поставят се 1 ml 3% H 2 O 2 върху чиста култура в плаки или клинове, които не съдържат кръв (за предпочитане хранителен агар). Наблюдавайте дали образуването на мехурчета съществува веднага. Можете също да използвате H 2 O 2 при 30%.
То се интерпретира по същия начин като метода за пренасяне на обекти.
- Метод с капилярна тръба или Фунг и Петришко
Напълнете капилярна тръба с височина 67 mm с височина 20 mm с 3% водороден пероксид чрез капилярност.
Докоснете изолираната колония, която искате да изучите, с капиляра, напълнена с 3% H 2 O 2 . Наблюдавайте дали капилярката е пълна с мехурчета за около 10 секунди. Този метод позволява полу-количествено определяне на реакцията при кръстосване:
Без кръстове няма мехурчета (отрицателна реакция).
+ ---- Малки мехурчета (слаба или забавена реакция).
++ Обилни мехурчета (умерена реакция).
+++ - Мехурчетата достигат противоположната крайност (енергична реакция).
- Метод Тейлър и Аханзар за каталазни тестове, които дават съмнение
На чист, сух слайд поставете изолирана колония, след това поставете капка от 0, 5% H 2 O 2 и покрийте с покривно стъкло. Наблюдавайте дали има образуване на затворени мехурчета.
Интерпретация: наличието на мехурчета показва положителна реакция. Без мехурчета се интерпретира като отрицателна реакция.
Каталазен тест за видове Mycobacterium
Тази техника трябва да се извърши чрез контролиране на рН и температурата. Той трябва да се изпълнява при ламинарен поток, тъй като обработката на различните видове Mycobacterium е опасна.
-Materials
Водороден пероксид при 30% или 110 обема (супероксал).
PH 7 фосфатен буфер
10% Tween 80
Култивиране на клин Mycobacterium 3 до 4 седмици
- Приготвяне на реактиви
PH 7 фосфатен буфер
Съжалението:
1.361 g безводен монокалиев фосфат (KH2P04).
1, 420 g безводен динатриев (Na2HPO3) фосфат.
И двете соли се разтварят в малко стерилна дестилирана вода и се допълват с вода до 1000 ml.
10% Tween 80
Направете разреждане 1:10 към Tween 80, който е концентриран в търговската мрежа, така че продължете както следва:
Взема се 1 ml Tween 80 и се поставя в малко дестилирана вода, разтваря се и след това обемът се допълва с вода до 10 ml.
Краен реагент
Смесете количество фосфатен буфер с количество от 10% Tween 80 (в равни части). Определете в лабораторията колко искате да подготвите.
-а процедура
Поставете 5 ml фосфатен буфер в стерилна епруветка с винтова капачка (бакелит).
С инокулационна верига, вземете достатъчно колония от растеж на Mycobacterium, засяти в клинове и разтворете във фосфатния буфер.
Покрийте тръбата, без да затегнете нишката твърде много. Поставя се на водна баня при 68 ° С в продължение на 20 до 30 минути. Отстранете и оставете да се охлади при 22-25 ° С
Измерва се 0, 5 ml от крайния реактив (смес) и се добавя към епруветката със студения разтвор. Наблюдавайте образуването на мехурчета или не.
То се тълкува като предишните техники.
употреба
Когато се получи растеж на колонии в обогатена среда, трябва да се извърши оцветяване по Грам и каталазен тест върху получените колонии. Това ще насочи микробиолога към процедурите, които трябва да се следват за окончателна идентификация.
Контрол на качеството
За да се оцени правилното функциониране на водородния пероксиден реагент, се използват прясно култивирани контролни щамове, като Staphylococcus aureus като положителна контрола и щамове на Streptococcus sp като отрицателна контрола.
Друга алтернатива, която служи като положителна контрола е да постави капка водороден пероксид върху кръвния агар, еритроцитите да имат каталаза, следователно ще има мехурчета, ако реагентът е в добро състояние.
Като отрицателна контрола може да се използва шоколадов агар, като еритроцитите вече са лизирани и тестът е отрицателен.
ограничения
- Не използвайте стари култури за теста, тъй като това може да доведе до фалшиви отрицателни резултати.
- Да се избягва вземането на колонии от култури в кръвен агар, ако се вземат мерки да не се докосва агарът; тази процедура може да предизвика фалшиви положителни резултати, тъй като еритроцитите съдържат каталаза.
-Ако вземете колонията с платинена дръжка, не променяйте реда на процедурата, защото това може да генерира фалшиви положителни резултати. Това е така, защото платината може да реагира с водороден пероксид, причинявайки барботиране.
- Не използвайте водородния пероксиден реагент, ако той е твърде стар, тъй като реагентът е много нестабилен и има тенденция да се разгражда с времето.
- Да се съхранява защитения от светлина и охлаждане реагент на водороден пероксид, за да се избегнат повреди.
- Извършване на качествен контрол на реагента с водороден пероксид всеки път, когато се използва.
- Вземете под внимание, че ако се използва H 2 O 2 при 30%, реакциите са по-силни от тези, които са направени с 3% H 2 O 2 .
